小鼠肺血管內(nèi)皮細胞是肺微循環(huán)的核心功能單元，參與氣體交換、炎癥調(diào)控及血管屏障維持。分離培養(yǎng)高純度PMVECs是研究肺血管生理病理機制的關(guān)鍵技術(shù)，以下為常用方法概述。
一、細胞分離
1.材料準備：選取6-8周齡健康C57BL/6小鼠，麻醉后無菌取肺組織；消化試劑含0.1%Ⅱ型膠原酶、0.01%DNA酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶，37℃預(yù)溫。
2.組織解離：肺組織剪碎后經(jīng)膠原酶消化30min，機械吹打至單細胞懸液，1000rpm離心5min去碎片；紅細胞裂解液處理5min去除紅細胞，PBS重懸后過40μm濾網(wǎng)。
3.內(nèi)皮細胞富集：利用內(nèi)皮細胞特異性貼壁特性，將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基預(yù)包被的培養(yǎng)皿，37℃、5%CO?孵育1-2h，未貼壁的成纖維細胞等雜質(zhì)經(jīng)換液去除，貼壁細胞即為初步富集的PMVECs。
二、原代培養(yǎng)
貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，采用含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素及1ng/mLVEGF的EGM-2MV專用培養(yǎng)基，每2-3天換液一次。細胞呈鋪路石樣生長，融合達80%-90%時可傳代，一般可傳3-5代保持表型穩(wěn)定。
三、細胞鑒定
1.形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下可見細胞為多邊形或鵝卵石樣，邊界清晰，單層融合時無明顯重疊。
2.免疫熒光標記：固定細胞后，用抗CD31（PECAM-1）、vWF（血管性血友病因子）或VE-cadherin（鈣黏蛋白）一抗孵育，F(xiàn)ITC標記的二抗顯色，熒光顯微鏡下可見胞膜或胞質(zhì)特異性陽性信號。
3.功能驗證：DiI-Ac-LDL攝取實驗（37℃孵育2h后胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光顆粒）；管腔形成實驗（Matrigel基質(zhì)上形成網(wǎng)狀管樣結(jié)構(gòu)）。
注意事項
分離過程需嚴格無菌操作，控制消化時間與溫度以避免細胞損傷；鑒定時需設(shè)置同型IgG陰性對照，排除非特異性染色。該方法可獲得純度＞90%的PMVECs，適用于肺血管屏障、炎癥及纖維化等研究。
更新時間：2025-12-11
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